Oporność na tyreotropinę wywołaną przez mutacje w genie receptora tyreotropiny cd

Startery zaprojektowano tak, aby produkt amplifikacji tworzył unikalne miejsce restrykcyjne tylko w obecności wariantu nukleotydu (metoda swoistego dla allelu specyficznego dla alleli trawienia endonukleazą) .11,12 Po powieleniu genomowego DNA osobników przez PCR, fragmenty DNA strawiono odpowiednimi enzymami, a następnie poddano elektroforezie w 3% żelu agarozowym NuSieve-1%. Częściowe odcięcie produktów PCR wskazuje, że zmutowany nukleotyd był obecny w jednym z dwóch alleli.
Konstrukcja wektorów ekspresji cDNA receptora tyreotropiny receptora dzikiego i zmutowanego
Pełnej długości cDNA receptora tyreotropowego typu dzikiego sklonowano w pSVL.13. Odpowiednie fragmenty DNA niosące każdą mutację i polimorfizm zidentyfikowany u pacjentów zastąpiono w celu wytworzenia wektorów eksprymujących alaninę w pozycji 162 (Ala162), treoniny w pozycji 52 i alaniny w pozycja 162 (Thr52-Ala162) i asparagina w pozycji 167 (Asn167). Ostateczne konstrukty zweryfikowano przez sekwencjonowanie.
Konstrukt reporter-gen, -846 a-Luc, reagujący na cykliczne AMP, 14 zawierał 846 par zasad (bp) sekwencji flankującej 5 i 44 pz egzonu genu podjednostki ludzkiej g glikoproteiny połączonej z lucyferazą. gen w plazmidzie pA3 Luc.
Badania czynnościowe receptorów tyreotropinowych w systemie przejściowej transfekcji
Komórki Cos-7 namnażano w zmodyfikowanej pożywce Eagle a Dulbecco (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.) Zawierającej 10% surowicy płodowej cielęcej w 37 ° C i 5% dwutlenku węgla. Komórki wysiewano na 12-studzienkowe płytki w stężeniach 2 x 105 komórek na studzienkę i transfekowano 24 godziny później metodą strącania fosforanem wapnia15 za pomocą .g wektora reporterowego, -846 .-Luc i .g każdego z Wektory ekspresji receptora tyreotropiny opisane powyżej. Osiem do 12 godzin po transfekcji komórki przemywano i inkubowano przez 48 godzin z kompletnym podłożem pod nieobecność lub w obecności różnych ilości rekombinowanej ludzkiej tyreotropiny (Genzyme, Cambridge, MA). Komórki poddawano lizie i testowano na aktywność lucyferazy (Promega, Madison, Wis.). Poszczególne punkty danych, które przedstawiamy, stanowią średnie (. zakres) dla podwójnych mieszanin inkubacyjnych, wyrażone jako wielokrotności podstawowego poziomu aktywności lucyferazy przy braku tyreotropiny.
Wyniki
Wyniki badań funkcji tarczycy u wszystkich członków rodziny przedstawiono w Tabeli 1. Charakterystyczne cechy tego zespołu w trzech córkach były wysokie stężenia tyreotropiny w surowicy i normalny wolny od surowicy wskaźnik T4, wolne T4 i wolne wartości T3. Oboje rodzice mieli nieznacznie zwiększone stężenia tyreotropiny w surowicy oraz prawidłowe stężenia T4 i T3 w surowicy. Przerwanie leczenia T4 u trzech dziewcząt spowodowało wzrost stężenia tyreotropiny w surowicy, chociaż wielkość tego wzrostu była zróżnicowana. Trzy i sześć miesięcy po odstawieniu leczenia T4, wartości T4 i wolnego T4 w surowicy były niższe niż wartości zmierzone podczas terapii, a u dwóch z trzech dziewcząt stężenia T3 w surowicy były wyższe. Po jednym roku wartości T4, T3 i wolnego T4 w surowicy były równe wartościom zmierzonym podczas leczenia T4
[przypisy: hipertonia, badanie krwi witamina d cena, mutacje somatyczne ]

Powiązane tematy z artykułem: badanie krwi witamina d cena hipertonia mutacje somatyczne